Mètodes

Les lacases termostables i no termostables es van recopilar de UniProt, NCBI i BRENDA utilitzant els filtres que proporcionen aquestes bases de dades. Les seqüències proteiques es van descarregar en format FASTA mitjançant un script de bash.

Per reduir la redundància de seqüències dins dels grups, les seqüències es van agrupar amb CD-HIT en grups representatius més petits.

A continuació, es van construir alineaments múltiples de seqüències de lacases termostables i no termostables utilitzant MAFFT. Per millorar-ne la qualitat i la usabilitat posterior, els alineaments es van retallar amb trimAl.

L’accessibilitat al solvent de cada residu en l’estructura de la CotA de B. subtilis (PDB: 1GSK) es va calcular amb FreeSASA. Els residus es van classificar com a enterrats o accessibles al solvent en funció d’un llindar d’accessibilitat relativa al solvent del 20% i es van exportar des de ChimeraX.

Què és l’accessibilitat al solvent?

L’accessibilitat al solvent mesura el grau d’exposició d’un aminoàcid determinat a les molècules d’aigua del seu entorn. S’expressa com a percentatge de l’exposició màxima possible per a aquell aminoàcid. Un valor proper al 0% significa que el residu es troba profundament enterrat dins la proteïna, mentre que un valor proper al 100% indica que està completament exposat a la superfície. Aquesta distinció és important perquè els residus enterrats i els de superfície tenen papers molt diferents en l’estructura i l’estabilitat de la proteïna.

Les matrius de puntuació específiques de posició (PSSM) es van generar a partir dels alineaments retallats utilitzant goalign. Prenent CotA com a referència, les files de la PSSM corresponents als residus enterrats i accessibles al solvent es van extreure per separat per a ambdós conjunts de dades mitjançant un script de Python personalitzat.

Es van aplicar tres anàlisis complementàries per comparar els dos grups. L’enriquiment de grups d’aminoàcids es va avaluar mitjançant tests de Chi-quadrat, les propietats fisicoquímiques es van comparar amb el test t de Student i el test de Mann-Whitney U, i la divergència de Kullback-Leibler es va utilitzar per identificar les posicions que més difereixen entre lacases termostables i no termostables.

Les posicions més discriminants es van cartografiar sobre l’estructura 1GSK mitjançant ChimeraX i el seu context estructural es va examinar per interpretar el seu possible paper en la termostabilitat.